Microscopia.

Microscopio óptico

Un microscopio óptico es un microscopio basado en lentes ópticos. También se le conoce como microscopio de luz, (que utiliza luz o "fotones" o microscopio de campo claro. El desarrollo de este aparato suele asociarse con los trabajos de Anton van Leeuwenhoek. Los microscopios de Leeuwenhoek constaban de una única lente pequeña y convexa, montada sobre una plancha, con un mecanismo para sujetar el material que se iba a examinar (la muestra o espécimen). Este uso de una única lente convexa se conoce como microscopio simple, en el que se incluye la lupa, entre otros aparatos ópticos.

Partes del microscopio óptico y sus funciones

1 * Ocular: lente situada cerca del ojo del observador. Capta y amplía la imagen formada en los objetivos.

2 * Objetivo: lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta, lo que significa que es muy importante este elemento del microscopio, es un elemento vital que permite ver a través de los oculares

3 * Condensador: lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación.

4 * Diafragma: regula la cantidad de luz que llega al condensador.

5 * Foco: dirige los rayos luminosos hacia el condensador.

6 * Tubo: es una cámara oscura unida al brazo mediante una cremallera.

7 * Revólver: Es un sistema que agarra los objetivos, y que rota para utilizar un objetivo u otro.

Con objetivos se refiere a los lentes objetivos que pueden girar y así ver el punto deseado de la muestra.

8 * Tornillos macro y micrométrico: Son tornillos de enfoque, mueven la platina hacia arriba y hacia abajo. El macrométrico lo hace de forma rápida y el micrométrico de forma lenta. Llevan incorporado un mando de bloqueo que fija la platina a una determinada altura.

9 * Platina: Es una plataforma horizontal con un orificio central, sobre el que se coloca la preparación, que permite el paso de los rayos procedentes de la fuente de iluminación situada por debajo. Dos pinzas sirven para retener el portaobjetos sobre la platina y un sistema de cremallera guiado por dos tornillos de desplazamiento permite mover la preparación de delante hacia atrás o de izquierda a derecha y viceversa.

Para resumir la plataforma donde vas a poner los bichos o la cosa que quieras ver.

10 * Base: Es la parte inferior del microscopio que permite el sostén del mismo.

Resolución: El microscopio optico tiene un limite resolucíon de cerca de 200 nm (0.2 µm ). Este limite se debe a la longitud de onda de la luz (0.4-0.7 µm ). Las celulas observadas bajo el microscopio optico pueden estar vivas o fijadas y teñidas.

Aplicaciones:

Área de la química: en el estudio de cristales

La física: en la investigación de las propiedades físicas de los materiales

La geología: en el análisis de la composición mineralógica de algunas rocas

En el campo de la biología: en el estudio de estructuras microscópicas de la materia viva

En el laboratorio de histología y anatomía patológica: el diagnóstico de certeza del cáncer, numerosas estructuras cristalinas, pigmentos, lípidos, proteínas, depósitos óseos, depósitos de amiloide, etcétera.

Microscopio de fluorescencia

Este microscopio hace uso de la fluorescencia y se convierte en una herramienta de inestimable valor para la investigación científica, ya que permite alcanzar altos niveles de sensibilidad y resolución microscópica, permitiendo una apreciación diferente de la información que se puede obtener de los especímenes y que generalmente pasa desapercibida.

La fluorescencia es un fenómeno de luminiscencia que fue observado inicialmente por Sir George Stokes en el año 1852, para luego ser explicada físicamente en el año 1935 por Alexander Jablonski. Es la propiedad que tienen ciertos elementos químicos denominados fluoróforos o fluorocromos de emitir luz visible cuando sobre ellos incide una radiación intensa; en otras palabras, absorben una luz de una longitud de onda determinada (por ejemplo luz ultravioleta o luz monocromática azul) y luego emiten otra luz de una mayor longitud de onda (de un determinado color, verde, rojo, amarillo). Es un fenómeno de luminiscencia de vida corta, emitida simultáneamente con la excitación.

Los términos de fluorocromo y fluoróforo definen los siguientes conceptos:

• Fluorocromo: Marcador colorante fluorescente empleado en investigación para crear contraste en zonas determinadas de los especímenes.

• Fluoróforo: Parte de una molécula (fluorocromo, proteína) que le imparte la propiedad de fluorescencia.

Requerimientos para el microscopio de fluorescencia

• Fuente de luz: Se necesita una intensa fuente de luz para excitar la fluorescencia en el espectro específico de cada fluorocromo. Hay que tomar en cuenta que la fluorescencia es pasajera y la iluminación produce un efecto de fotoblanqueo en el fluorocromo; además, las células vivas pueden ser dañadas por la intensa radiación. La luz debe ser de una longitud de onda corta. Se emplean lámparas de mercurio a alta presión que funcionan de un modo diferente a las lámparas de filamentos incandescentes. También se utiliza luz ultravioleta y rayos laser. Muchos modelos funcionan con epi-iluminación .

• Filtros: Son los que permiten el paso de luz de una determinada longitud de onda, la del rango y color necesario para excitar al fluorocromo y bloquean las longitudes no deseadas. Una vez filtrada, la luz incide sobre el espécimen por reflexión de un espejo dicroico (epi-iluminación) y es nuevamente filtrada para poder ser observada.

• Objetivos: Deben tener gran capacidad para transmitir la luz y proveer una imagen de alta calidad. De igual manera deben poseer una gran apertura numérica.

Aplicaciones del microscopio de fluorescencia

• Marcaje de moléculas en células y tejidos para su caracterización e identificación.

• Estudio de células normales y patológicas.

• Estudios inmunológicos.

• Mineralogía.

Microscopio confocal

Es un instrumento que permite realizar cortes ópticos finos a muestras de tejidos más o menos gruesos y realizar reconstrucciones en tres dimensiones a partir de cortes seriados. Fue inventado en el año 1955 por el científico estadounidense Marvin Minsky al estudiar neuronas. Su mecanismo, basado en el microscopio de fluorescencia hace posible la obtención de imágenes de la arquitectura tridimensional de células y tejidos.

Los detalles de la óptica del microscopio confocal son complejos y complementado por métodos electrónicos y de computación, este instrumento permite enfocar únicamente un plano determinado del espécimen, eliminando la luz (fluorescencia) procedente de las regiones que no están en el plano de enfoque.

Ventajas del microscopio confocal

• Uso de la fluorescencia (epi-fluorescencia).

• Enfoca un solo plano del espécimen.

• Elimina la información proveniente de otros planos no enfocados del espécimen.

• Obtención de cortes ópticos seriados a partir de muestras con cierto grosor o cuyo corte fino se dificulta.

• Gracias a programas de computación, se combinan los cortes ópticos seriados y a partir de ellos se reconstruye en tres dimensiones la estructura observada.

Configuración del microscopio confocal

Los microscopios confocal modernos son instrumentos altamente sofisticados y sus elementos principales son:

• La fuente de luz: Generalmente emplea una fuente de luz muy poderosa (laser o lámpara de arco). Se pueden utilizar sistemas de rayos laser multi-frecuencia (en el rango ultravioleta, luz visible e infra-roja) adaptados a los tipos de marcadores fluorescentes empleados para el contraste de los elementos celulares. Se han desarrollado dos técnicas, la de escaneo con un solo rayo (laser) y el escaneo con múltiples rayos.

• Sistema óptico: El sistema óptico de los microscopios está basado en los principios fundamentales que se mantienen inalterados, sin embargo están complementados con los avances en óptica moderna y la tecnología electrónica.

• Filtros de interferencia: Incluyen espejos dicromáticos o dicroicos, barreras con agujero de diámetro variable y diversos filtros de excitación (para seleccionar la longitud de onda de excitación del fluorocromo).

• Detectores: Son fotodetectores muy sensibles a la fluorescencia emitida. Para los microscopios con múltiples rayos generalmente se usan cámaras CCD (charge- coupled device).

• Computadora: Configurada con los requisitos suficientes de memoria y procesador, tarjetas de video de alta resolución, complementadas con software de captura, análisis y procesamiento de imágenes, así como también de impresoras de muy alta calidad.

Aplicaciones del microscopio confocal

En comparación a los otros tipos de microscopios, el microscopio confocal proporciona un método altamente sofisticado y mejorado para obtener imágenes.

En investigaciones en el campo de la biología celular y biomedicina es muy útil para medir procesos dinámicos y realizar videos para capturar secuencias en muy corto tiempo en células vivas.

• Procesos celulares: Para medir actividades enzimáticas, reacciones de oxidación, pH intracelular, fagocitosis, apoptosis, comunicaciones intercelulares. Electrofisiología.

• Estudios de ADN y ARN.

• Morfología de organoides citoplasmáticos.

• Cirugía y otros métodos clínicos.

• Otras aplicaciones en el campo de la física, la química y en tecnología alimentaria.

Microscopio electrónico de transmisión (TEM)

Los microscopios electrónicos más sencillos constan de dos lentes formadoras de la imagen de forma muy parecida a los microscopios ópticos convencionales. La iluminación proviene de un cañón de electrones emitidos por un filamento de W o LaB6. Los electrones son acelerados al aplicar un potencial negativo  (100 kV - 1000 kV) y focalizados mediante dos lentes condensadoras sobre una muestra delgada, transparente a los electrones.

Después de pasar a través de la muestra los electrones son recogidos y focalizados por la lente objetivo dentro de una imagen intermedia ampliada. La imagen es ampliada aún más gracias a las lentes proyectoras, las cuales controlan la ampliación de la imagen en la pantalla fluorescente. La imagen final se proyecta sobre una pantalla fluorescente o una película fotográfica.

Las partes principales de un microscopio electrónico de Transmisión son:

Cañón de electrones: genera el barrido electrónico que proporciona la imagen.

Lentes magnéticas: encargadas de enfocar el haz electrónico.

Sistema de vacío es una parte muy importante del microscopio electrónico. Debido a que los electrones pueden ser desviados por las moléculas del aire, se debe hacer un vacío casi total en el interior de un microscopio de estas características. Para conseguir este flujo constante de electrones se debe operar a bajas presiones. Esto se realiza para favorecer el contraste de carga entre cátodo y tierra sin que se produzca un arco eléctrico.

Placa fotográfica o pantalla fluorescente: se coloca detrás del objeto a visualizar para registrar la imagen aumentada.

Sistema de registro: que muestra la imagen que producen los electrones, que suele ser una computadora.

Resolución:

Resolución podría llegar hasta 5 nm siempre y cuando se consiguiera aumentos de ´50.000  lo que es posible utilizando un vidrio de aumento sobre la imagen fluorescente en el microscopio, o un incremento fotográfico de la imagen registrada en la película. Los microscopios de gran resolución (tres lentes generadoras de imagen) son capaces de ampliar la imagen hasta 500.000 veces y tienen poderes de resolución de unas fracciones de nm. Normalmente poseen aumentos de entre  ´1000 - ´200.000 ó de  ´2500 - ´500.000.

aplicaciones del Microscopio electrónico de transmisión:

• Estudios de ultraestructura de tejidos vegetales, animales y humanos (91,92, 93).

• Realización de estudios de histoquímica e inmunohistoquímica para identificar compuestos específicos.

• Reconocimiento de virus y sus características ultraestructurales.

• Estudios de citoquímica.

• Estudios de estructuras moleculares.

• Determinación de estructura cristalina en minerales, metales y otros materiales.

• Estudio de fases y zonas cristalinas en polímeros.

• Determinación del tamaño de partículas.

• Cambios estructurales de materiales sometidos a diferentes tratamientos.

Microscopia electronica de barrido

En el microscopio electrónico de barrido, un campo magnetico permite enfocar los rayos catódicos (electrones) y obtener una imagen tridimensional, por el examen de la superficie de las estructuras, permitiendo la observación y la caracterización de materiales orgánicos e inorgánicos, proporciona aumentos de 200.000 diámetros.

 Von Ardenne, en 1.938, construyó el primer Microscopio Electrónico de Barrido (MEB); posteriormente, en Inglaterra, se construyó el primer MEB Ambiental, con el cual se pueden observar muestras hidratadas.

Descripción del Equipo

El MEB consta de las siguientes partes:

1. Cañón de electrones (e-).

2. Filamento de tungsteno o de hexaboruro de lantano-LaB6.

3. Anodo.

4. Columna en vacío.

5. Lentes condensadores (centran y dirigen el rayo de electrones).

6. Lentes Objetivas (controlan la cantidad de electrones del haz).

7. Detectores para colectar y medir electrones (producción de imagen).

8. Bobinas de barrido (obligan al haz a barrer la muestra).

9. Control de aumento.

10. Generador de barrido.

11. Colector de electrones (electrones  se atraen y se aceleran).

12. Escintilador (convierte la energía cinetica de los e- en luz visible).

13. Amplificador.

14. Pantalla (imagen).

Aplicaciones

·         Obtención de imágenes 3D.

·         Caracterización  estructural.

·         Estudio de características morfológicas y topográficas.

·         Estudio de enfermedades del tallo piloso.

·         Estudio de formación de biofilms.

·         Interacción de microorganismos con células eucariotas.

Microscopio de efecto túnel

El microscopio de efecto túnel, como su nombre lo indica, se aprovecha del efecto túnel, uno de los más encantadores (y sorprendentes) resultados de la mecánica cuántica. Para ésta, una partícula como un electrón no está ubicada exactamente en un lugar, sino que puede interpretarse como una onda más o menos extendida: no se le puede atribuir una posición puntual, sino una nube de posiciones en las cuales la partícula podría encontrarse. Semejante ubicuidad permite cosas que hubieran horrorizado a cualquier físico (y seguramente a cualquier partícula) precuántico, por ejemplo, que un electrón pueda - con cierta probabilidad - escapar de un átomo, remontando las poderosas cadenas electromagnéticas que lo amarran a él, como si hubiera practicado un túnel a través de la barrera de potencial que lo tiene confinado.

Insidiosa pero deliberadamente, el microscopio de efecto túnel se aprovecha de estas habilidades escapatorias de los electrones. Una sonda (un electrón extremadamente fino) se acerca a una distancia muy corta (unos diez millonésimos de milimetro) de la superficie del metal a observar: entre la punta de la superficie reina el más estricto vacío y una pequeña diferencia de potencial eléctrico.

Resolución

Menos de un décimo del radio promedio de un átomo, y ha permitido obtener mapas muy precisos de superficies de metales o de semiconductores, en los que cada átomo puede distinguirse de su vecino (ayuda inapreciable para las necesidades de la microelectrónica moderna), y ha proporcionado también imágenes atómicas de moléculas de ADN.

Aplicaciones:

En la física: con aplicaciones particulares en la física de semiconductores y microelectrónica.

En química: reacciones superficiales también cumplen un rol importante, por ejemplo, catálisis.

El microscopio de efecto túnel trabaja mejor con materiales conductores, pero es también posible preparar moléculas orgánicas en una superficie y estudiar sus estructuras.

Por ejemplo, esta técnica ha sido usada en el estudio de moléculas de ADN.

La MET, dio lugar a grandes avances en la llamada Nanoingenieria. Cuanto más pequeño se diseñan los dispositivos, mayor es la influencia en su comportamiento y desempeño del orden atómico de sus materiales constituyentes.

Microscopio de Fuerza Atómica

El Microscopio de Fuerza Atómica (AFM) es un instrumento mecano-óptico capaz de detectar fuerzas del orden de los nanonewton.  Al analizar una muestra, es capaz de registrar continuamente la altura sobre la superficie de una sonda o punta cristalina de forma piramidal.  La sonda va acoplada a un listón microscópico, muy sensible al efecto de las fuerzas, de sólo unos 200 µm de longitud.

Partes:

La fuerza atómica se puede detectar cuando la punta está muy próxima a la superficie de la muestra.   Es posible entonces  registrar la pequeña flexión del listón mediante un haz laser reflejado en su parte posterior.  Un sistema auxiliar piezoeléctrico desplaza la muestra tridimensionalmente, mientras que la punta recorre ordenadamente la superficie. Todos los movimientos son controlados por una computadora.

La resolución:

Rs de menos de 1 nm, y la pantalla de visualización permite distinguir detalles en la superficie de la muestra con una amplificación de varios millones de veces.

Tipos de medidas, modos de operación y aplicaciones

El microscopio de AFM puede realizar dos tipos de medidas: imagen y fuerza.

En el modo de imagen la superficie es barrida en el plano de la superficie (X-Y) por la punta. Durante el barrido la fuerza interatómica entre los átomos de la punta y los átomos en la superficie muestral provoca una flexión del listón. Esta flexión es registrada por un sensor adecuado (normalmente balanza óptica) y la señal obtenida se introduce en un circuito o lazo de realimentación. Este último controla un actuador piezoeléctrico que determina la altura (Z) de la punta sobre la muestra de forma que la flexión del listón se mantenga a un nivel constante (Normalmente introducido por el operador). Representando la altura de la punta (Z) frente a su posición sobre la muestra (X, Y) es posible trazar un mapa topográfico de la muestra Z=Z(X, Y). La fuerza interatómica se puede detectar cuando la punta está muy próxima a la superficie de la muestra.

En medidas de fuerza la punta se hace oscilar verticalmente mientras se registra la flexión del listón. La medida se expresa entonces representando fuerza (F) frente a altura (Z) sobre la muestra. Las medidas de fuerza son útiles en estudios de fuerzas de adhesión y permiten estudiar a nivel de una sola molécula interacciones específicas entre moléculas (ej: interacción antígeno-anticuerpo, interacción entre hebras complementarias de ADN) o interacciones estructurales de las biomoléculas (plegado de proteínas) así como caracterizar la elasticidad de polímeros. También es útil en estudios de indentación de materiales blandos (polímeros) que permitan caracterizar propiedades elásticas de la muestra como el módulo de elasticidad o viscoelásticas.